近日，BioTechniques的記者講述了研究人員如何借助新一代測序技術，來加速他們的人類互作組（interactome）研究。
1993年，系統(tǒng)生物學家Marc Vidal開始醞釀，繪制出活細胞內每個蛋白之間的所有相互作用。那時大部分科學家正沉浸在基因測序的喜悅之中，但Vidal對蛋白更感興趣。他想，如果所有基因都測序完成，那么下一個合理的目標將是繪制出所謂的蛋白互作組。
然而，這并非一件簡單的工作。那時，酵母雙雜交篩選只有四年，且實驗很耗時。關于蛋白相互作用的測定，還沒有高通量的方法。但隨著測序的費用開始下降，Vidal開始覺得潮流變了。
如今，Vidal及其他人已經(jīng)繪制了超過20%的人類互作組。互作組學領域的科學家們已經(jīng)開發(fā)出一些方法，優(yōu)化酵母雙雜交篩選和新一代測序。但這是一個很小的領域，他們的結果受限于高的假陰性和假陽性。因此，他們在不斷開發(fā)新技術和新的計算方法，以協(xié)助他們的研究。
當科學家在測序人類基因組時，他們明確知道他們在做什么?；蚪M是線性的，您可以準確找到起點和終點。對于互作組，就沒那么簡單了。人類細胞至少編碼了20,000個蛋白，而每個蛋白都有可能與其他任一蛋白相互作用。這樣就有2億對蛋白要檢驗。
Stitch-seq技術
在經(jīng)典的酵母雙雜交研究中，目的蛋白（誘餌）融合在酵母轉錄因子GAL4的DNA結合域（DBD），它與報告基因的上游結合。GAL4的轉錄激活域（AD）與文庫中的每個蛋白（獵物）融合，以檢測它們與誘餌蛋白的可能相互作用。隨后每個獵物-AD融合蛋白與誘餌-DBD融合蛋白共表達。如果獵物蛋白與誘餌蛋白結合，那么GAL4轉錄因子將會重建，導致報告基因的表達。利用這種方法，一個基因的所有結合伴侶都可以鑒定出。
酵母雙雜交的高通量版本則加快了蛋白間相互作用的鑒定步伐，但受限于需要Sanger測序來確定互作伴侶。新一代測序（NGS）將大大加速此過程，但考慮到所有互作伴侶的PCR擴增子的合并將消除每一對之間的特異關聯(lián)，這不太適用。去年，Vidal開發(fā)出一種名為Stitch-seq的方法，將NGS應用在酵母雙雜交篩選中。
Stitch-seq的關鍵步驟在于PCR拼接（PCR stitching），這種PCR方法將每個相互作用伴侶的兩個序列連接成單個PCR擴增子，之后再進行合并。Vidal表示：“這種方法的魅力在于我們拼接的方式，我們在兩個片段之間引入了一段已知核苷酸。它是*自動的。”DNA序列的拼接確保了相互作用伴侶對在新一代測序時的關聯(lián)。
他們的策略使整體費用降低了近40%，并允許通量增加。隨著新一代測序技術的不斷改善，測序費用會持續(xù)下降。他們在研究中選擇了454 GS FLX測序平臺。之所以選擇這個平臺，是因為454技術是新一代測序中讀長zui長的，而82 bp的接頭長度要求平均讀長要超過100 bp，才能可靠鑒定相互作用序列標簽。
然而，Stitch-seq的缺點在于它仍然依賴酵母雙雜交。韋恩州立大學醫(yī)學院的生物學家Russ Finley談道：“我對這種技術又愛又恨。”酵母雙雜交常常伴隨著假陽性和假陰性。“你會得到很大的圖譜，包括數(shù)千個相互作用，其中一些是好的，也有很多垃圾，還有一些漏掉了。”
因此，F(xiàn)inley和他的同事轉向新的計算方法來分類雙雜交數(shù)據(jù)，同時他們也在等待加速數(shù)據(jù)采集過程的技術?，F(xiàn)在的問題在于，還沒有技術來驗證酵母雙雜交的數(shù)據(jù)，甚至充分了解漏掉了什么。
但科學家們能依賴他們了解的：蛋白表達和功能的數(shù)據(jù)。如果兩個蛋白從未或很少在同一組織或同時表達，那么很可能不會發(fā)生相互作用。類似地，如果已知兩個蛋白的功能迥異，那么它們也不大會相互作用。諸如此類的數(shù)據(jù)可用于評估酵母雙雜交數(shù)據(jù)中相互作用的可能性。此外，F(xiàn)inley的小組提出一種方法，綜合不同的數(shù)據(jù)集，以此為基礎為相互作用數(shù)據(jù)一個置信值。如果不同實驗室利用不同方法都證明了相互作用，那么其置信值更高。
互作組生物學
一旦人類互作組繪制出，下一個問題是它將有什么用。與人類基因組相似，一旦圖譜完成，以及出現(xiàn)新技術來采集和分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)的力量才有可能變得更清晰。不過，科學家已經(jīng)顯示了互作組數(shù)據(jù)在研究細胞生物學和疾病狀態(tài)上的作用。
去年，馬普研究院分子遺傳學研究所的Ulrich Szl及其同事發(fā)表了超過500萬對蛋白的分析，并預測了94,000多個新的相互作用。為了*時間發(fā)現(xiàn)蛋白對，他們并沒有依賴培養(yǎng)皿中的酵母雙雜交，而是利用機器人控制矩陣。它加速了過程，使其自動化。
為了證明有效性，他的研究小組從阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、側索硬化癥和帕金森氏癥的全基因組關聯(lián)研究中借來了一些數(shù)據(jù)，并與新的互作組數(shù)據(jù)相比對。他們利用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)來發(fā)現(xiàn)關聯(lián)多個疾病基因的蛋白和通路。研究小組繼續(xù)引入激酶，以便研究化的變化如何改變網(wǎng)絡。
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